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细胞培养常见问题及其解决

时间:2015-10-30 19:17来源:网络 作者:佚名 点击: 点击此处获得【转发赠送积分】网址
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细胞培养常见问题及其解决

1. 如何选用特殊细胞系培养基?



培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞,很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之,首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始。

2. 何时须更换培养基?



视细胞生长密度而定, 或遵照细胞株基本数据上之更换时间,按时更换培养基即可。

3. 可否使用与原先培养条件不同之培养基?



不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基, 若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基, 细胞大都无法立即适应, 造成细胞无法存活。

4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类?



不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源,所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清, 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同,血清使用错误常会造成细胞无法存活。

5 何谓FBS, FCS, CS, HS ?



FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思, 两者都是指胎牛血清, FCS 乃错误的使用字眼, 请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。

6 培养细胞时应使用5 % 或10% CO2?或根本没有影响?



一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H 作为pH 的缓冲系统, 而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时,细胞培养时应使用10 % CO2;当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时, 则应使用5 % CO2 培养细胞。

7.Hank's 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用,不需要CO2培养箱。原因是什么?Hank's 平衡盐溶液(HBS)和Earle's平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别?



HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡,以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中,溶液会变碱,Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织,需要用Eagles液,。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织,用Hanks液就可以了。

8. 细胞之接种密度为何?



依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。

9. 悬浮性细胞应如何继代处理?



一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中, 稀释细胞浓度即可, 若培养液太多时, 可将培养角瓶口端稍微抬高, 直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶, 加入新鲜培养基稀释至适当浓度, 重复前述步骤即可。

10.冷冻管应如何解冻?



取出冷冻管后, 须立即放入37 °C 水槽中快速解冻, 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化, 并注意水面不可超过冷冻管盖沿, 否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时, 必须注意安全, 预防冷冻管之爆裂。

11. 细胞冷冻管解冻培养时, 是否应马上去除DMSO?



除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外, 绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞), 在解冻之后, 应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中, 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可, 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。

12. 附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度?应如何处理?



一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中, 保存于–20 °C,避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活性降低, 并可减少污染之机会。

13.欲将一般动物细胞离心下来,其离心速率应为多少转速?



欲回收动物细胞, 其离心速率一般为300xg (约1,000rpm),5 - 10 分钟, 过高之转速, 将造成细胞死亡。

14. 细胞冷冻培养基之成份为何?



动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意:由于DMSO 稀释时会放出大量热能, 故不可将DMSO 直接加入细胞液中, 必须使用前先行配制完成。

15.DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何?



冷冻保存使用之DMSO 等级, 必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650), 其本身即为无菌状况, 第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中, 保存于4°C, 避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质, 并可减少污染之机会。若要过滤DMSO, 则须使用耐DMSO 之Nylon 材质滤膜。

16.冷冻保存细胞之方法?



冷冻保存方法一: 冷冻管置于4 °C 30~60 分钟→ (-20 °C30 分钟*) → -80 °C 16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 长期储存。

冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 °C 至–80 °C 以下, 再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20 °C 不可超过1 小时, 以防止冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-80°C 冰箱中,惟存活率稍微 降低一些。

17. 细胞欲冷冻保存时, 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度?



冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial, 融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。

18.培养基中是否须添加抗生素?



除于特殊筛选系统中外, 一般正常培养状态下, 培养基中不应添加任何抗生素。

19.应如何避免细胞污染?



细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。

20.如果细胞发生微生物污染时,应如何处理?



原则上:直接灭菌后丢弃之。

当重要的培养污染时,研究者可能试图消除或控制污染。首先,确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母,把污染细胞与其它细胞系隔离开,用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台,检查HEPA过滤器。
高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性,因而,做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。

1.在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞,稀释到常规细胞传代的浓度。

2.分散细胞悬液到多孔培养板中,或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内,把选择抗生素加入到每一个孔中。例如,两性霉素B推荐下列浓度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。

3.每天观测细胞毒性指标,如脱落,出现空泡,汇合度下降和变圆。

4.确定抗生素毒性水平后,使用低于毒性浓度2~3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2~3代。

5.在无抗生素的培养基中培养细胞一代。

6.重复步骤4。

7.在无抗生素的培养基中培养4~6代,确定污染是否以已被消除。

21.支原体(mycoplasma) 污染的细胞, 是否能以肉眼观察出异状?



不能。除极有经验之专家外,大多数遭受支原体污染的细胞株, 无法以其外观分辨之。

22.支原体污染会对细胞培养有何影响?



支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数, 代谢及研究之任一数据。故进行实验前,必须确认细胞为mycoplasma-free,实验结果之数据方有意义。

23. 侦测出细胞株有支原体污染时, 该如何处理?



直接灭菌后丢弃,以避免污染其它细胞株。

24. CO2 培养箱之水盘如何保持清洁?



定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。

(责任编辑:hai)
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