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293T细胞的培养实验步骤

时间:2015-10-30 19:18来源:网络 作者:佚名 点击: 点击此处获得【转发赠送积分】网址
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用于包装的293T细胞(ATCC No. CRL-11268)必需选择处于生长旺盛期,细胞状态较佳,存活率90%以上,细胞边缘清晰,传代次数较低。任何时候细胞汇合率都不准达到100

包装细胞293T细胞的培养

293t细胞的培养主要有以下步骤:

一、293T细胞的冻存

1. 随着传代的次数增加,293T细胞会出现生长状态下降,出现突变等。所以要在细胞购进时就进行大量冻存,以保证实验的稳定性和持续性。

2. 在细胞对数生长期进行冻存,增加细胞复苏成活率。

3. 倒去细胞上清液,加入D-Hank's液洗去残留的培养基。

4. 加入0.25%的胰酶,消化10-20s后倒去。

5. 镜下观察细胞变圆,细胞间间隙加大时,加入新鲜培养基吹打混匀。

6. 细胞计数。

7. 将细胞离心,1000rpm,2min。

8.根据计数结果加入细胞冻存液(70%完全培养基+ 20% FBS + 10% DMSO)重悬细胞,密度为3×106个/ml。

9. 分装进细胞冻存管,放入泡沫盒中,放入-80℃超低温冰箱。

10. 第二天将细胞放入液氮灌,并记录。

11. 复苏检测细胞存活率,细胞状态等,并记录。

二. 293T细胞的传代

1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作,以扩大细胞数量,维持细胞良好的生长状态。

2. 消化细胞,方法同上。

3. 细胞离心结束后,加入完全培养基重悬。密度为3×105个/ml。

4. 分到10cm培养皿中,10ml/皿。

5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。

三. 293T细胞的复苏

1. 当细胞传代次数过多(超过50代),细胞状态变差时或细胞出现污染事故时,需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。

2. 打开水浴锅,设置温度为40℃。

3. 查看细胞库记录,根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞(需戴上棉手套,防止被冻伤),迅速丢入水浴锅中并快速晃动,在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。

4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。

5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。

6. 第二天观察细胞存活率。倒掉旧的培养基,加入10ml新鲜培养基。

293T细胞的培养实验步骤

关键步骤:推荐使用Qiagen质粒大抽试剂盒或相当的试剂盒所制备的质粒。

6. 室温孵育20分钟,使DNA和Trans-EZ充分结合形成转染复合体。

7. 取1支5ml的移液管,将得到的DNA-Trans-EZ复合体均匀滴加入到细胞培养板中,每板3ml。来回晃动培养板,混匀后放回到5%二氧化碳培养箱。每一皿细胞培养盘不要超过6盘。

8. 6小时后,移去细胞上清,更换为17ml的DMEM完全培养基。

9. 转染后一天观察细胞,所有的细胞应当都是健康的并且密度接近60-80%。如果所转染质粒带有GFP荧光,那么这时候可以看到大于95%的细胞都是带有荧光的。

10. 将细胞送回培养箱继续培养2天(36-48小时)。在这个过程中,细胞会逐渐融合形成多核体,大多数的细胞依然贴壁。

11. 收集所有的上清,分装到50ml离心管中。

12 4℃,500g离心10分钟,除去脱落的细胞和大的细胞碎片。

13 总的上清约为204 ml,用250-ml 0.45 μm PVDF过滤装置过滤。如果发现滤膜被堵住,表现为过滤速度变慢,更换新的滤器。

作者:weiyanjie 点击:次

(责任编辑:hai)
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